Οι ασκήσεις του κεφαλαίου είναι τριών ειδών: μέτρημα κομματιών και δεσμών μετά από κοπή, εύρεση τμημάτων και γονιδίων σε αλληλουχίες, και επιλογή του σωστού ενζύμου, πλασμιδίου ή ανιχνευτή. Σε κάθε βήμα γράφε και την αιτιολόγηση: στις Πανελλήνιες βαθμολογείται.
Κοπή με περιοριστική ενδονουκλεάση
Τι υπολογίζω
Σχέση
Προσοχή
Κομμάτια από γραμμικό μόριο
= θέσεις κοπής + 1
Πυρηνικό DNA ευκαρυωτικών.
Κομμάτια από κυκλικό μόριο
= θέσεις κοπής
Πλασμίδια, βακτηριακό και μιτοχονδριακό DNA.
Δεσμοί που σπάνε ανά θέση (EcoRI)
2 φωσφοδιεστερικοί + 8 υδρογόνου
4 ζεύγη A–T ανάμεσα στις τομές.
Νουκλεοτίδια μονόκλωνου άκρου (EcoRI)
4 (AATT)
Έχουν 2 A και 2 T και δεν σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου.
Φωσφοδιεστερικοί γραμμικού δίκλωνου τμήματος
= νουκλεοτίδια − 2
Ισχύει και όταν έχει μονόκλωνα άκρα.
Μήκος ανασυνδυασμένου πλασμιδίου
= πλασμίδιο + ένθεμα
Η θέση αναγνώρισης υπάρχει πλέον 2 φορές.
PCR, υβριδοποίηση, cDNA
Τι υπολογίζω
Σχέση
Προσοχή
Μόρια μετά από ν κύκλους PCR
= αρχικά μόρια × 2ν
Νουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν
= (2ν − 1) × νουκλεοτίδια μορίου
Τα νουκλεοτίδια του αρχικού μορίου υπήρχαν ήδη.
Νέες αλυσίδες
= 2·2ν − 2
Οι 2 αρχικές αλυσίδες διατηρούνται.
Βάσεις του αρχικού μορίου
= βάσεις προϊόντος ÷ 2ν
Όλα τα μόρια είναι πανομοιότυπα.
Δεσμοί υδρογόνου ανιχνευτή
= 2·(A + U ή T) + 3·(G + C)
Με τις βάσεις του ανιχνευτή.
Ζεύγη βάσεων δίκλωνου cDNA
= νουκλεοτίδια ώριμου mRNA
Χωρίς εσώνια.
Ασκήσεις με αλληλουχία και EcoRI
Βρες τον προσανατολισμό. Αν δεν δίνονται τα άκρα, βρες πρώτα την κωδική αλυσίδα: ψάξε ATG και, σε ακέραιο αριθμό τριάδων μετά, TAA, TAG ή TGA.
Βρες τις θέσεις. Ψάξε το GAATTC διαβάζοντας 5΄→3΄. Η αλληλουχία είναι ίδια στις δύο αλυσίδες, οπότε αρκεί να τη βρεις στη μία.
Κόψε. Ανάμεσα στο G και στο A σε κάθε αλυσίδα. Κάθε τομή αφήνει μονόκλωνο άκρο 5΄-AATT-3΄.
Έλεγξε το κομμάτι. Σε πλασμίδιο μπαίνει μόνο κομμάτι με μονόκλωνα άκρα και στις δύο πλευρές.
Ποιο ένζυμο ή ποιο πλασμίδιο
Το ένζυμο πρέπει να κόβει εκατέρωθεν του γονιδίου (και του υποκινητή του, αν θέλουμε να εκφραστεί) και όχι μέσα σε αυτό.
Το πλασμίδιο πρέπει να έχει τη θέση μία φορά, και όχι στη θέση έναρξης της αντιγραφής.
Αν η θέση είναι μέσα σε γονίδιο ανθεκτικότητας, τα βακτήρια με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο χάνουν αυτή την ανθεκτικότητα και ξεχωρίζουν.
2Λυμένο παράδειγμα
Δίνεται τμήμα DNA οργανισμού-δότη: 5΄-CTGAATTCAATGTCCAAGGTTTGAGAATTCGA-3΄ 3΄-GACTTAAGTTACAGGTTCCAAACTCTTAAGCT-5΄
και ένα πλασμίδιο 4.000 ζευγών βάσεων, με μία θέση αναγνώρισης της EcoRI. α) Ποια κομμάτια δίνει η EcoRI; β) Πόσους δεσμούς σπάει στο τμήμα; γ) Ποιο κομμάτι μπορεί να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο; δ) Πόσα ζεύγη βάσεων έχει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο; ε) Ποιο πεπτίδιο κωδικοποιεί το κομμάτι;
α) Η πάνω αλυσίδα έχει δύο φορές το 5΄-GAATTC-3΄. Η EcoRI κόβει ανάμεσα στο G και στο A κάθε αλυσίδας και προκύπτουν τρία κομμάτια: 5΄-CTG-3΄ / 3΄-GACTTAA-5΄ 5΄-AATTCAATGTCCAAGGTTTGAG-3΄ / 3΄-GTTACAGGTTCCAAACTCTTAA-5΄ 5΄-AATTCGA-3΄ / 3΄-GCT-5΄
β) Δύο θέσεις κοπής, σε καθεμία 2 φωσφοδιεστερικοί δεσμοί και 8 δεσμοί υδρογόνου: 4 φωσφοδιεστερικοί και 16 δεσμοί υδρογόνου.
γ) Μόνο το μεσαίο, γιατί έχει μονόκλωνα άκρα και στις δύο πλευρές του. Τα ακραία έχουν μονόκλωνο άκρο μόνο στη μία.
δ) Κάθε αλυσίδα του μεσαίου κομματιού έχει 22 νουκλεοτίδια. Όταν ενωθεί με το ανοιχτό πλασμίδιο, τα μονόκλωνα άκρα ζευγαρώνουν και προστίθενται 22 ζεύγη: 4.022 ζεύγη βάσεων. Η θέση της EcoRI υπάρχει τώρα δύο φορές.
ε) Κωδική είναι η πάνω αλυσίδα: έχει ATG και, μετά από ακέραιο αριθμό τριάδων, TGA. mRNA: 5΄-AUG-UCC-AAG-GUU-UGA-3΄. Πεπτίδιο: H2N – μεθειονίνη – σερίνη – λυσίνη – βαλίνη – COOH, 4 αμινοξέα. Για να εκφραστεί στο βακτήριο χρειάζεται και κατάλληλο υποκινητή.
3Πολλαπλής επιλογής
Πάτα μια απάντηση για να δεις αν είναι σωστή.
Η διαδικασία εισαγωγής των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων στα βακτήρια ονομάζεται:
Μετασχηματισμός. Κλωνοποίηση είναι η δημιουργία κλώνων βακτηρίων.
Τα δύο είδη DNA, του πλασμιδίου και του οργανισμού-δότη, αναμειγνύονται και ενώνονται:
Τα συμπληρωματικά άκρα ζευγαρώνουν, η DNA δεσμάση τα ενώνει και προκύπτει ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες:
Και οι τρεις προτάσεις ισχύουν.
Μια cDNA βιβλιοθήκη περιέχει:
Περιέχει αντίγραφα των mRNA των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα από τα οποία φτιάχτηκε.
Η αποδιάταξη, δηλαδή το σπάσιμο των δεσμών υδρογόνου και ο αποχωρισμός των δύο αλυσίδων του DNA, γίνεται:
Τα ένζυμα των άλλων επιλογών δρουν σε φωσφοδιεστερικούς δεσμούς, και οι ανιχνευτές υβριδοποιούν.
Σε κάθε θέση όπου κόβει, η EcoRI σπάει:
Έναν φωσφοδιεστερικό σε κάθε αλυσίδα, και τους δεσμούς υδρογόνου των 4 ζευγών A–T ανάμεσα στις τομές (4 × 2).
Ένα κυκλικό πλασμίδιο με 3 θέσεις αναγνώρισης μιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης κόβεται σε:
Στο κυκλικό μόριο τα κομμάτια είναι όσα και οι θέσεις κοπής. Στο γραμμικό θα ήταν 4.
Από ένα δίκλωνο μόριο DNA, μετά από 5 κύκλους PCR, υπάρχουν:
2⁵ = 32.
4Σωστό ή λάθος
Πάτα μια απάντηση για να δεις αν είναι σωστή.
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες κόβουν το DNA σε θέσεις με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων.
Αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4 έως 8 νουκλεοτιδίων.
Το DNA του πλασμιδίου και το DNA του δότη ενώνονται με τη βοήθεια της RNA πολυμεράσης.
Ενώνονται με την DNA δεσμάση.
Η διαδικασία δημιουργίας του ανασυνδυασμένου DNA ονομάζεται μετασχηματισμός.
Μετασχηματισμός είναι η εισαγωγή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου στο βακτήριο.
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται τεχνητά και έλυσαν το πρόβλημα της κατασκευής ανασυνδυασμένου DNA.
Παράγονται φυσιολογικά από βακτήρια.
Η EcoRI κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ των νουκλεοτιδίων C και A.
Κόβει μεταξύ G και A.
Οι ιχνηθετημένοι ανιχνευτές περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές προς το κλωνοποιημένο DNA.
Γι’ αυτό υβριδοποιούν μόνο το DNA που ψάχνουμε.
Η PCR επιτρέπει να αντιγράψουμε ειδικές αλληλουχίες DNA χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανών κυττάρων.
Γίνεται σε δοκιμαστικό σωλήνα.
Τα πλασμίδια κόβονται με διαφορετική περιοριστική ενδονουκλεάση από αυτήν που κόβει το DNA του δότη.
Με την ίδια, ώστε να προκύψουν συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα.
Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη ενός ανθρώπου είναι ίδια από όποιο σωματικό του κύτταρο κι αν κατασκευαστεί.
Όλα τα σωματικά κύτταρα έχουν το ίδιο DNA.
Η cDNA βιβλιοθήκη από ηπατικά κύτταρα είναι ίδια με αυτήν από νευρικά κύτταρα του ίδιου ατόμου.
Κάθε κυτταρικός τύπος εκφράζει διαφορετικά γονίδια, άρα έχει διαφορετικά mRNA.
Το cDNA ενός ασυνεχούς γονιδίου περιέχει εσώνια.
Συντίθεται με καλούπι το ώριμο mRNA, που δεν έχει εσώνια.
Κάθε κλώνος μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης περιέχει ολόκληρο το DNA του δότη.
Κάθε κλώνος έχει ένα κομμάτι. Όλοι μαζί έχουν το συνολικό DNA.
Τα βακτήρια-ξενιστές πρέπει, πριν από τον μετασχηματισμό, να είναι ανθεκτικά στο αντιβιοτικό της επιλογής.
Πρέπει να είναι ευαίσθητα, αλλιώς θα επιβίωναν και όσα δεν πήραν πλασμίδιο.
Υβριδοποίηση μπορεί να γίνει και ανάμεσα σε μια αλυσίδα DNA και μια αλυσίδα RNA.
Αρκεί να είναι συμπληρωματικές.
Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιεί ως καλούπι DNA.
Χρησιμοποιεί RNA και συνθέτει DNA.
Ένα κομμάτι DNA με μονόκλωνο άκρο μόνο στη μία πλευρά του μπορεί να ενσωματωθεί σε πλασμίδιο κομμένο με EcoRI.
Χρειάζεται μονόκλωνα άκρα και στις δύο πλευρές για να κλείσει ο κύκλος.
5Συμπλήρωση κενών
Συμπλήρωσε τα κενά και μετά δες την απάντηση.
Οι τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό αποτελούν τη .
Δείξε την απάντηση
Γενετική Μηχανική.
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από και ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να τα από την εισβολή .
Δείξε την απάντηση
βακτήρια, προστατεύουν, ξένου DNA.
Η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων ονομάζεται .
Δείξε την απάντηση
κλωνοποίηση.
Για να κατασκευαστεί μια , απομονώνεται το ολικό ώριμο mRNA από κύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο.
Δείξε την απάντηση
cDNA βιβλιοθήκη.
Το mRNA χρησιμοποιείται ως για τη σύνθεση μιας αλυσίδας , με τη βοήθεια του ενζύμου .
Η PCR επιτρέπει να αντιγράψουμε επιλεκτικά ειδικές αλληλουχίες από ένα σύνθετο μείγμα μορίων, χωρίς τη μεσολάβηση .
Δείξε την απάντηση
DNA, ζωντανών κυττάρων.
Η EcoRI αναγνωρίζει την αλληλουχία 5΄--3΄ και κόβει κάθε αλυσίδα ανάμεσα στο και στο .
Δείξε την απάντηση
GAATTC, G, A.
Η σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA, ή DNA με RNA, ονομάζεται και γίνεται με δεσμούς .
Δείξε την απάντηση
υβριδοποίηση, υδρογόνου.
6Ερωτήσεις θεωρίας
Τύπου Θέματος Β. Προσπάθησε πρώτα να απαντήσεις μόνος σου και μετά άνοιξε την απάντηση.
Γενετική Μηχανική και περιοριστικές ενδονουκλεάσες
Πού βρίσκει εφαρμογές η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA;
Δείξε την απάντηση
Έδωσε στον άνθρωπο την ικανότητα όχι μόνο να ερευνά αλλά και να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών. Εφαρμόζεται στην παραγωγή σειράς προϊόντων, όπως πρωτεϊνών, και στη δημιουργία φυτών και ζώων με «βελτιωμένες» ιδιότητες.
Τι ονομάζουμε Γενετική Μηχανική και ποιους στόχους εξυπηρετεί;
Δείξε την απάντηση
Το σύνολο των τεχνικών με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό. Άνοιξε τον δρόμο για νέες παραγωγικές και ερευνητικές δυνατότητες και εξυπηρετεί δύο θεμελιώδεις στόχους: την κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης, και τη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσης του ανθρώπου.
Ποια είναι, συνοπτικά, τα στάδια της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA;
Δείξε την απάντηση
Κατασκευή του ανασυνδυασμένου DNA. Μεταφορά του σε κύτταρο-ξενιστή (μετασχηματισμός). Επιλογή και απομόνωση των ξενιστών που το προσέλαβαν. Επιλογή του βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθυμητό DNA.
Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες; Ποιος είναι ο φυσιολογικός τους ρόλος και πού τις χρησιμοποιούμε; Δώσε ένα παράδειγμα.
Δείξε την απάντηση
Ένζυμα που παράγονται από βακτήρια και κόβουν το δίκλωνο DNA σε ειδικές αλληλουχίες 4 έως 8 νουκλεοτιδίων. Φυσιολογικά προστατεύουν το βακτήριο από την εισβολή ξένου DNA. Στο εργαστήριο χρησιμοποιούνται για να κόβεται το DNA του δότη και του φορέα κατά την κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA. Παράδειγμα η EcoRI, από το Escherichia coli.
Ποια αλληλουχία αναγνωρίζει η EcoRI και πού κόβει; Πόσους και ποιους δεσμούς σπάει όταν η αλληλουχία υπάρχει μία φορά σε ένα μόριο;
Δείξε την απάντηση
Αναγνωρίζει την αλληλουχία 5΄-GAATTC-3΄ (3΄-CTTAAG-5΄ στην απέναντι αλυσίδα), τόσο σε πλασμίδια όσο και σε ευκαρυωτικό DNA. Κόβει κάθε αλυσίδα ανάμεσα στο G και στο A, με κατεύθυνση 5΄→3΄, και αφήνει μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις. Σπάει 2 φωσφοδιεστερικούς δεσμούς, έναν σε κάθε αλυσίδα, και 8 δεσμούς υδρογόνου (4 ζεύγη A–T).
Γιατί το DNA του δότη και ο φορέας κόβονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση;
Δείξε την απάντηση
Για να αποκτήσουν τα ίδια μονόκλωνα άκρα. Μόνο τότε τα άκρα τους είναι συμπληρωματικά, ζευγαρώνουν με δεσμούς υδρογόνου και μπορεί η DNA δεσμάση να τα ενώσει.
Κλωνοποίηση και φορείς
Ποιους φορείς κλωνοποίησης γνωρίζεις και ποιος είναι ο ρόλος τους;
Δείξε την απάντηση
Τα πλασμίδια και το DNA φάγων, όπως του βακτηριοφάγου λ. Δέχονται το ξένο DNA, το μεταφέρουν στο κύτταρο-ξενιστή και, επειδή αντιγράφονται ανεξάρτητα μέσα σε αυτό, το πολλαπλασιάζουν.
Σύγκρινε τη χρήση των πλασμιδίων και των ιών ως φορέων κλωνοποίησης.
Δείξε την απάντηση
Τα πλασμίδια είναι ο συνηθέστερος φορέας και χρησιμοποιούνται για οργανισμούς με μικρό γονιδίωμα, γιατί δεν μπορούν να ενσωματώσουν μεγάλα κομμάτια DNA. Το DNA των φάγων, όπως του βακτηριοφάγου λ, ενσωματώνει μεγαλύτερα κομμάτια ξένου DNA. Η διαδικασία της κλωνοποίησης είναι παρόμοια.
Ποιος είναι ο ρόλος της DNA δεσμάσης στον σχηματισμό του ανασυνδυασμένου DNA;
Δείξε την απάντηση
Όταν το DNA του πλασμιδίου και του δότη αναμειχθούν, τα συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα τους ζευγαρώνουν. Η DNA δεσμάση σχηματίζει τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς που ενώνουν μόνιμα τα δύο είδη DNA σε ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.
Γιατί τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια και είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά;
Δείξε την απάντηση
Η επιλογή στηρίζεται στην ανάπτυξη παρουσία αντιβιοτικού. Αν οι ξενιστές είχαν ήδη πλασμίδια με γονίδια ανθεκτικότητας, θα επιβίωναν και όσοι δεν πήραν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, και η επιλογή θα ήταν αδύνατη.
Πώς εισάγονται τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια στα βακτήρια;
Δείξε την απάντηση
Με μετασχηματισμό. Μετά από κατάλληλη κατεργασία, τα τοιχώματα των βακτηρίων γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια και το πλασμίδιο περνά στο κύτταρο.
Πώς ξεχωρίζουν τα βακτήρια που προσέλαβαν ανασυνδυασμένο DNA από τα υπόλοιπα;
Δείξε την απάντηση
Με καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό με το κατάλληλο αντιβιοτικό: επιβιώνουν μόνο όσα πήραν πλασμίδιο, που φέρει γονίδιο ανθεκτικότητας. Ο κλώνος με το συγκεκριμένο τμήμα DNA εντοπίζεται στη συνέχεια με ειδικό ανιχνευτή.
Περίγραψε τα στάδια της κλωνοποίησης με φορέα το DNA του βακτηριοφάγου λ.
Δείξε την απάντηση
Απομονώνεται το ολικό DNA του δότη. Το DNA του δότη και το DNA του φάγου κόβονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση. Αναμειγνύονται και, με DNA δεσμάση, σχηματίζονται ανασυνδυασμένα μόρια DNA φάγου. Οι ανασυνδυασμένοι φάγοι μολύνουν βακτήρια-ξενιστές και πολλαπλασιάζονται μέσα σε αυτά, δίνοντας πολλά αντίγραφα του ξένου DNA. Ο κλώνος με το επιθυμητό τμήμα επιλέγεται με ανιχνευτή.
Ποια είναι η σημασία της καθολικότητας του γενετικού κώδικα για την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA;
Δείξε την απάντηση
Επειδή ο κώδικας είναι σχεδόν καθολικός, το mRNA ενός οργανισμού μεταφράζεται σωστά από τα ριβοσώματα και τα tRNA ενός άλλου. Έτσι ένα βακτήριο που έχει προσλάβει ανθρώπινο γονίδιο μπορεί να συνθέσει την ανθρώπινη πρωτεΐνη.
Ένα γονίδιο ενσωματώθηκε σε πλασμίδιο, αλλά δεν εκφράζεται στο μετασχηματισμένο βακτήριο. Ποιοι μπορεί να είναι οι λόγοι;
Δείξε την απάντηση
Το γονίδιο μπορεί να μην έχει μπροστά του υποκινητή που να αναγνωρίζεται από την RNA πολυμεράση του βακτηρίου. Αν είναι ευκαρυωτικό με εσώνια, το βακτήριο δεν μπορεί να κάνει ωρίμανση. Η περιοριστική ενδονουκλεάση μπορεί να έκοψε μέσα στο γονίδιο ή να απομάκρυνε μέρος του. Το γονίδιο μπορεί να μπήκε με αντίστροφο προσανατολισμό ως προς τον υποκινητή. Τέλος, η πρωτεΐνη μπορεί να χρειάζεται τροποποιήσεις μετά τη μετάφραση που το βακτήριο δεν κάνει.
Βιβλιοθήκες
Τι είναι η γονιδιωματική βιβλιοθήκη και πώς κατασκευάζεται;
Δείξε την απάντηση
Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού-δότη. Το DNA του δότη κόβεται με περιοριστική ενδονουκλεάση σε χιλιάδες κομμάτια, που ενσωματώνονται, με DNA δεσμάση, σε πλασμίδια κομμένα με το ίδιο ένζυμο. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια με μετασχηματισμό, τα βακτήρια επιλέγονται με αντιβιοτικό και το καθένα δίνει έναν κλώνο.
Πώς ονομάζεται το DNA που συντίθεται με καλούπι mRNA από την αντίστροφη μεταγραφάση;
Δείξε την απάντηση
cDNA, δηλαδή συμπληρωματικό DNA.
Περίγραψε την πορεία κατασκευής μιας cDNA βιβλιοθήκης.
Δείξε την απάντηση
Απομονώνονται τα κύτταρα όπου εκφράζεται το γονίδιο και από αυτά το ολικό ώριμο mRNA. Με καλούπι το mRNA, η αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει συμπληρωματικές αλυσίδες cDNA και προκύπτουν υβριδικά μόρια mRNA–cDNA. Το mRNA διασπάται με χημικές ουσίες ή με θέρμανση. Με καλούπι το cDNA, η DNA πολυμεράση συνθέτει τη δεύτερη αλυσίδα. Τα δίκλωνα μόρια ενσωματώνονται σε πλασμίδια με περιοριστική ενδονουκλεάση και DNA δεσμάση. Ακολουθούν μετασχηματισμός, καλλιέργεια με αντιβιοτικό, επιλογή και δημιουργία των κλώνων.
Ποιος είναι ο ρόλος της αντίστροφης μεταγραφάσης στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA;
Δείξε την απάντηση
Χρησιμοποιεί ως καλούπι τα ώριμα mRNA ενός κυτταρικού τύπου και συνθέτει συμπληρωματικές αλυσίδες DNA (cDNA). Είναι το πρώτο βήμα για την κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης.
Ποια ένζυμα χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία βιβλιοθηκών;
Δείξε την απάντηση
Και στις δύο βιβλιοθήκες: περιοριστική ενδονουκλεάση και DNA δεσμάση. Στη cDNA επιπλέον: αντίστροφη μεταγραφάση και DNA πολυμεράση.
Ποιες είναι οι διαφορές μιας γονιδιωματικής και μιας cDNA βιβλιοθήκης;
Δείξε την απάντηση
Η γονιδιωματική περιέχει το συνολικό DNA του δότη, έχει πολύ μεγάλο αριθμό κλώνων, και τα τμήματά της είναι ολόκληρα γονίδια, μέρη γονιδίων ή DNA που δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνες, με εξώνια και εσώνια. Η cDNA περιέχει μόνο αντίγραφα των mRNA των γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα, έχει λιγότερους κλώνους, περιέχει μόνο εξώνια, διαφέρει από ιστό σε ιστό και χρειάζεται δύο επιπλέον ένζυμα.
Γιατί χρησιμοποιούμε cDNA και όχι γονιδιωματικές βιβλιοθήκες για να παράγουμε ανθρώπινες πρωτεΐνες σε μεγάλες ποσότητες;
Δείξε την απάντηση
Τα περισσότερα ανθρώπινα γονίδια έχουν εσώνια και τα βακτήρια δεν διαθέτουν μηχανισμό ωρίμανσης, οπότε δεν θα έδιναν τη σωστή πρωτεΐνη. Το cDNA περιέχει μόνο την πληροφορία των εξωνίων. Επιπλέον η cDNA βιβλιοθήκη έχει λιγότερους κλώνους, που όλοι αντιστοιχούν σε γονίδια, και το επιθυμητό γονίδιο εντοπίζεται ευκολότερα.
Υβριδοποίηση και PCR
Πώς δρα η θέρμανση στο DNA κατά την αποδιάταξη; Ποια μέθοδος βασίζεται στην αποδιάταξη και στην επανασύνδεση των αλυσίδων;
Δείξε την απάντηση
Η θέρμανση σπάει τους δεσμούς υδρογόνου ανάμεσα στις δύο αλυσίδες, που αποχωρίζονται χωρίς να καταστραφούν. Η μέθοδος είναι η υβριδοποίηση: η σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA ή DNA–RNA, που χρησιμοποιείται με ιχνηθετημένους ανιχνευτές. Στα ίδια φαινόμενα στηρίζεται και η PCR.
Πώς χρησιμοποιείται η υβριδοποίηση για τον εντοπισμό ενός κλώνου σε γονιδιωματική ή cDNA βιβλιοθήκη;
Δείξε την απάντηση
Χρησιμοποιούνται ιχνηθετημένοι ανιχνευτές, δηλαδή μονόκλωνα μόρια DNA ή RNA με αλληλουχία συμπληρωματική προς το DNA που ψάχνουμε. Το DNA των κλώνων αποδιατάσσεται και αναμειγνύεται με τους ανιχνευτές, οι οποίοι υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό τους DNA. Έτσι εντοπίζεται, ανάμεσα σε χιλιάδες κλώνους, αυτός που περιέχει το επιθυμητό τμήμα.
Τι γνωρίζεις για την PCR και τις εφαρμογές της;
Δείξε την απάντηση
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης επιτρέπει να αντιγράψουμε επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές, ειδικές αλληλουχίες DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανών κυττάρων. Άρχισε να εφαρμόζεται ευρέως το 1985 και αύξησε την ευαισθησία των γενετικών αναλύσεων. Χρησιμοποιείται στην Ιατρική για τη διάγνωση ασθενειών όπως το AIDS, στην εγκληματολογία για τη διαλεύκανση υποθέσεων και στη μελέτη DNA από απολιθώματα.
Γράψε δύο μεθόδους με τις οποίες παράγονται πολλά αντίγραφα μιας αλληλουχίας DNA.
Δείξε την απάντηση
Η κλωνοποίηση, δηλαδή η ενσωμάτωση της αλληλουχίας σε φορέα και ο πολλαπλασιασμός της μέσα σε βακτήρια-ξενιστές, και η PCR, που γίνεται σε δοκιμαστικό σωλήνα χωρίς ζωντανά κύτταρα.
Θέλουμε να εντοπίσουμε και να μελετήσουμε το γενετικό υλικό ενός RNA ιού. Μπορούμε να εφαρμόσουμε PCR;
Δείξε την απάντηση
Όχι απευθείας. Η DNA πολυμεράση της PCR χρησιμοποιεί ως καλούπι μόνο DNA. Μπορούμε όμως πρώτα να συνθέσουμε cDNA από το RNA του ιού με αντίστροφη μεταγραφάση και μετά να εφαρμόσουμε την PCR στο cDNA.
7Ασκήσεις
Τύπου Θέματος Γ και Δ. Οι αριθμοί και οι αλληλουχίες είναι αλλαγμένοι σε σχέση με τα συνηθισμένα φυλλάδια. Λύσε πρώτα την άσκηση και μετά άνοιξε τη λύση.
Με τη δράση της EcoRI, ένα μόριο DNA από τον πυρήνα ανθρώπινου κυττάρου κόπηκε σε 36 κομμάτια. α) Σε πόσα σημεία κόπηκε; β) Πόσους δεσμούς έσπασε η EcoRI; γ) Πόσα κατάλληλα πλασμίδια χρειάζονται για να κατασκευαστεί βιβλιοθήκη του μορίου; δ) Πόσους δεσμούς θα σπάσει η EcoRI στα πλασμίδια αυτά; ε) Τι θα άλλαζε στα α και β αν το μόριο ήταν μιτοχονδριακό;
Δείξε τη λύση
α) Το πυρηνικό DNA είναι γραμμικό, άρα 36 κομμάτια προκύπτουν από 35 θέσεις κοπής. β) Σε κάθε θέση σπάνε 2 φωσφοδιεστερικοί δεσμοί και 8 δεσμοί υδρογόνου (4 ζεύγη A–T). Σύνολο: 70 φωσφοδιεστερικοί και 280 δεσμοί υδρογόνου. γ) Ένα πλασμίδιο για κάθε κομμάτι: 36. Αυστηρά, τα δύο ακραία κομμάτια έχουν μονόκλωνο άκρο μόνο στη μία πλευρά και δεν μπορούν να ενσωματωθούν. Αν η άσκηση το ζητά, γράψε 34 και εξήγησέ το. δ) Κάθε πλασμίδιο έχει τη θέση μία φορά: 36 × (2 + 8), δηλαδή 72 φωσφοδιεστερικοί και 288 δεσμοί υδρογόνου. ε) Το μιτοχονδριακό DNA είναι κυκλικό: 36 κομμάτια σημαίνουν 36 θέσεις κοπής, άρα 72 φωσφοδιεστερικοί και 288 δεσμοί υδρογόνου.
Ένα μόριο DNA έχει την αλληλουχία που αναγνωρίζει η EcoRI 12 φορές. α) Πόσα κομμάτια θα προκύψουν με τη δράση της EcoRI; β) Πόσοι δεσμοί θα σπάσουν;
Δείξε τη λύση
α) Αν το μόριο είναι γραμμικό, 13 κομμάτια. Αν είναι κυκλικό, 12. β) Και στις δύο περιπτώσεις η EcoRI κόβει 12 φορές: 12 × 2 = 24 φωσφοδιεστερικοί και 12 × 8 = 96 δεσμοί υδρογόνου.
Δίκλωνο μόριο DNA έχει 1.500 ζεύγη βάσεων και 350 αδενίνες. Με την EcoRI κόβεται σε 16 κομμάτια. Βρες: α) τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και τους δεσμούς υδρογόνου του μορίου, β) πόσοι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί και πόσοι δεσμοί υδρογόνου έμειναν στα 16 κομμάτια.
Δείξε τη λύση
α) A = T = 350 και G = C = 1.500 − 350 = 1.150. Δεσμοί υδρογόνου: 2·350 + 3·1.150 = 4.150. Φωσφοδιεστερικοί: αν είναι γραμμικό 3.000 − 2 = 2.998, αν είναι κυκλικό 3.000. β) Γραμμικό: 15 θέσεις κοπής, σπάνε 30 φωσφοδιεστερικοί και 120 δεσμοί υδρογόνου. Μένουν 2.968 και 4.030. Κυκλικό: 16 θέσεις κοπής, σπάνε 32 και 128. Μένουν 2.968 και 4.022.
Ένα τμήμα DNA που έχει κοπεί με EcoRI έχει δύο μονόκλωνα άκρα. Αποτελείται συνολικά από 1.268 νουκλεοτίδια, από τα οποία 380 έχουν G ή C. Υπολόγισε το σύνολο των φωσφοδιεστερικών δεσμών και των δεσμών υδρογόνου του τμήματος.
Δείξε τη λύση
Κάθε μονόκλωνο άκρο έχει 4 αζευγάρωτα νουκλεοτίδια (AATT), άρα στο δίκλωνο μέρος βρίσκονται 1.268 − 8 = 1.260 νουκλεοτίδια. A + T συνολικά: 1.268 − 380 = 888. Τα 8 είναι στα μονόκλωνα άκρα, οπότε στο δίκλωνο μέρος A + T = 880, δηλαδή 440 ζεύγη A–T. Ζεύγη G–C: 380 ÷ 2 = 190. Δεσμοί υδρογόνου: 2·440 + 3·190 = 1.450. Φωσφοδιεστερικοί (δύο γραμμικές αλυσίδες): 1.268 − 2 = 1.266. Σύνολο δεσμών: 2.716.
Η EcoRI κόβει ένα μικρό γραμμικό δίκλωνο μόριο DNA σε δύο τμήματα, το Κ και το Λ. Το Κ έχει 172 νουκλεοτίδια, από τα οποία 34 έχουν αδενίνη. α) Πόσες είναι οι άλλες βάσεις του Κ; β) Πόσους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και πόσους δεσμούς υδρογόνου έχει το Κ; γ) Αν το αρχικό μόριο είχε 320 φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και 70 αδενίνες, βρες τις βάσεις του Λ.
Δείξε τη λύση
Το Κ είναι ακραίο τμήμα, άρα έχει ένα μονόκλωνο άκρο 5΄-AATT-3΄ (2 A και 2 T). α) Δίκλωνο μέρος: 172 − 4 = 168 νουκλεοτίδια. Αδενίνες στο δίκλωνο μέρος: 34 − 2 = 32, άρα και 32 θυμίνες. G = C = (168 − 64) ÷ 2 = 52. Συνολικά στο Κ: A = 34, T = 34, G = 52, C = 52. β) Η μικρή αλυσίδα έχει 84 νουκλεοτίδια (83 δεσμοί) και η μεγάλη 88 (87 δεσμοί): 170 φωσφοδιεστερικοί. Δεσμοί υδρογόνου: 2·32 + 3·52 = 220. γ) Το αρχικό μόριο είχε 320 + 2 = 322 νουκλεοτίδια, άρα το Λ έχει 322 − 172 = 150. Αδενίνες του Λ: 70 − 34 = 36. Επειδή στο αρχικό A = T = 70, θυμίνες του Λ: 70 − 34 = 36. G = C = (150 − 72) ÷ 2 = 39. Άρα A = 36, T = 36, G = 39, C = 39.
Ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο DNA κόβεται από μια περιοριστική ενδονουκλεάση σε δύο κομμάτια. Το ένα έχει 240 ζεύγη βάσεων και 70 κυτοσίνες. Το άλλο έχει 318 φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και 410 δεσμούς υδρογόνου. α) Πόσες φορές υπάρχει στο μόριο η αλληλουχία που αναγνωρίζει το ένζυμο; β) Πόσες A, T, G και C έχει το αρχικό μόριο; Θεώρησε ότι το ένζυμο αφήνει δίκλωνα άκρα.
Δείξε τη λύση
α) Κυκλικό μόριο, 2 κομμάτια: 2 φορές. β) 1ο κομμάτι: 480 νουκλεοτίδια, C = G = 70, άρα A = T = (480 − 140) ÷ 2 = 170. 2ο κομμάτι: γραμμικό, 318 + 2 = 320 νουκλεοτίδια. 2A + 2G = 320 και 2A + 3G = 410, άρα G = C = 90 και A = T = 70. Συνολικά: A = T = 240, G = C = 160.
Ένα δίκλωνο μόριο DNA έχει δύο φορές την αλληλουχία που αναγνωρίζει η BamHI και τέσσερις φορές αυτήν που αναγνωρίζει η HindIII. Με ταυτόχρονη επίδραση των δύο ενζύμων κόβεται σε 6 κομμάτια. Είναι κυκλικό ή γραμμικό;
Δείξε τη λύση
Οι θέσεις κοπής είναι συνολικά 6. Ένα γραμμικό μόριο θα έδινε 7 κομμάτια, ένα κυκλικό 6. Άρα το μόριο είναι κυκλικό.
Γραμμικό δίκλωνο μόριο DNA μήκους 20 kb (1 kb = 1.000 ζεύγη βάσεων) κόβεται από την περιοριστική ενδονουκλεάση Α σε δύο τμήματα, 13 kb και 7 kb. Η περιοριστική ενδονουκλεάση Β το κόβει σε δύο τμήματα, 5 kb και 15 kb. Πόσα τμήματα, και τι μεγέθους, δίνει η ταυτόχρονη επίδραση των δύο ενζύμων;
Δείξε τη λύση
Κάθε ένζυμο κόβει μία φορά, άρα με τα δύο μαζί προκύπτουν 3 τμήματα. Το μέγεθός τους εξαρτάται από το άκρο από το οποίο απέχει 5 kb η θέση της Β: Αν η θέση της Β είναι 5 kb από το άκρο του τμήματος των 13 kb: 5, 8 και 7 kb. Αν είναι 5 kb από το άλλο άκρο, μέσα στο τμήμα των 7 kb: 13, 2 και 5 kb.
Η EcoRI αναγνωρίζει μια αλληλουχία 6 ζευγών βάσεων και η HaeIII μια αλληλουχία 4 ζευγών βάσεων. Το DNA ενός ευκαρυωτικού κυττάρου μοιράζεται σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες και σε καθέναν προστίθεται ένα από τα δύο ένζυμα. Σε ποιον σωλήνα περιμένεις περισσότερα κομμάτια;
Δείξε τη λύση
Στον σωλήνα με την HaeIII. Μια συγκεκριμένη αλληλουχία 4 ζευγών βάσεων εμφανίζεται τυχαία κάθε 4⁴ = 256 ζεύγη περίπου, ενώ μια αλληλουχία 6 ζευγών κάθε 4⁶ = 4.096. Η μικρότερη αλληλουχία υπάρχει πολύ περισσότερες φορές στο γονιδίωμα.
Το DNA του φάγου λ έχει 9,6·10⁴ νουκλεοτίδια. Πόσες το πολύ διαφορετικές πρωτεΐνες μέσου μοριακού βάρους 30.000 θα μπορούσε να κωδικοποιεί; Το μέσο μοριακό βάρος των αμινοξέων είναι 100.
Δείξε τη λύση
Κάθε πρωτεΐνη έχει 30.000 ÷ 100 = 300 αμινοξέα, άρα χρειάζεται 301 κωδικόνια (με το κωδικόνιο λήξης), δηλαδή 903 νουκλεοτίδια μιας αλυσίδας. Το DNA είναι δίκλωνο: 4,8·10⁴ ζεύγη, και κάθε γονίδιο χρησιμοποιεί τη μία αλυσίδα. 48.000 ÷ 903 = 53,2. Άρα το πολύ 53 πρωτεΐνες (χωρίς υποκινητές και άλλες αλληλουχίες).
Γράψε τα τμήματα που προκύπτουν από το παρακάτω DNA μετά τη δράση της EcoRI: 5΄…GCAGAATTCGTTA…3΄ 3΄…CGTCTTAAGCAAT…5΄
Δείξε τη λύση
Η EcoRI κόβει μεταξύ G και A στην αλληλουχία 5΄-GAATTC-3΄ κάθε αλυσίδας: 1ο τμήμα: 5΄…GCAG-3΄ και 3΄…CGTCTTAA-5΄ 2ο τμήμα: 5΄-AATTCGTTA…3΄ και 3΄-GCAAT…5΄ Αν οι προσανατολισμοί ήταν οι αντίθετοι, δεν θα υπήρχε θέση αναγνώρισης.
Δίνεται τμήμα DNA οργανισμού-δότη, χωρίς να σημειώνονται τα άκρα των αλυσίδων: TTCCTTAAGGATCAGTGAACCTTTCACGGTATCACTTAAGGCT AAGGAATTCCTAGTCACTTGGAAAGTGCCATAGTGAATTCCGA Σε ένα από τα κομμάτια που δίνει η EcoRI υπάρχει ένα μικρό γονίδιο. α) Βρες τον προσανατολισμό των αλυσίδων. β) Γράψε τα κομμάτια που δίνει η EcoRI. γ) Πόσα αμινοξέα κωδικοποιεί το γονίδιο;
Δείξε τη λύση
α) Ψάχνω ATG και, σε ακέραιο αριθμό τριάδων μετά, κωδικόνιο λήξης. Τα βρίσκω μόνο στην πάνω αλυσίδα διαβασμένη από δεξιά προς τα αριστερά: ATG GCA CTT TCC AAG TGA. Άρα η πάνω είναι η κωδική, με το 5΄ άκρο της δεξιά, και η κάτω έχει το 5΄ άκρο της αριστερά. β) Η κάτω αλυσίδα, 5΄→3΄, έχει δύο φορές το GAATTC. Προκύπτουν τρία κομμάτια (γραμμένα με την κάτω αλυσίδα 5΄→3΄): 5΄-AAGG-3΄ / 3΄-TTCCTTAA-5΄ 5΄-AATTCCTAGTCACTTGGAAAGTGCCATAGTG-3΄ / 3΄-GGATCAGTGAACCTTTCACGGTATCACTTAA-5΄ 5΄-AATTCCGA-3΄ / 3΄-GGCT-5΄ γ) Το γονίδιο βρίσκεται στο μεσαίο κομμάτι. mRNA: 5΄-AUG-GCA-CUU-UCC-AAG-UGA-3΄. Το UGA είναι κωδικόνιο λήξης, άρα 5 αμινοξέα (μεθειονίνη, αλανίνη, λευκίνη, σερίνη, λυσίνη).
Δίνεται το μόριο DNA: 5΄-TCAGAATTCGGATGCCGTTAGGTTAGCAAGAATTCACT-3΄ 3΄-AGTCTTAAGCCTACGGCAATCCAATCGTTCTTAAGTGA-5΄ Το μόριο κόβεται με EcoRI και εισάγεται σε κατάλληλο φορέα, ώστε να παραχθεί σε βακτήριο το ολιγοπεπτίδιο που κωδικοποιεί. Από ποια αμινοξέα αποτελείται;
Δείξε τη λύση
Η αλληλουχία GAATTC υπάρχει δύο φορές. Το τμήμα που προκύπτει ανάμεσα στις δύο τομές είναι: 5΄-AATTCGGATGCCGTTAGGTTAGCAAG-3΄ 3΄-GCCTACGGCAATCCAATCGTTCTTAA-5΄ Κωδική είναι η πάνω αλυσίδα: έχει ATG και, μετά από ακέραιο αριθμό τριάδων, TAG. mRNA: 5΄-AAUUCGG·AUG·CCG·UUA·GGU·UAG·CAAG-3΄. Ολιγοπεπτίδιο: H2N – μεθειονίνη – προλίνη – λευκίνη – γλυκίνη – COOH. Αντικωδικόνια με τη σειρά: 3΄-UAC-5΄, 3΄-GGC-5΄, 3΄-AAU-5΄, 3΄-CCA-5΄.
Στο παρακάτω μόριο DNA θέλουμε να κλωνοποιήσουμε το υπογραμμισμένο τμήμα, για να παράγουμε το ολιγοπεπτίδιο που κωδικοποιεί: 5΄-TGGATCCGGCCATGAAAGGCCTTTCTTGAGGCCGGATCCA-3΄ 3΄-ACCTAGGCCGGTACTTTCCGGAAAGAACTCCGGCCTAGGT-5΄ Διαθέτουμε την HaeIII, που κόβει στην αλληλουχία 5΄-GGCC-3΄, και την BamHI, που αναγνωρίζει την αλληλουχία 5΄-GGATCC-3΄. α) Ποιο ένζυμο θα χρησιμοποιήσουμε; β) Ποια είναι η ακολουθία των αμινοξέων του ολιγοπεπτιδίου;
Δείξε τη λύση
α) Η HaeIII βρίσκει την αλληλουχία GGCC πιο κοντά στα άκρα του τμήματος, αλλά και μέσα σε αυτό (AAAGGCCTT), οπότε θα το κομμάτιαζε. Η BamHI βρίσκει την αλληλουχία GGATCC μόνο εκατέρωθεν του τμήματος. Επιλέγουμε την BamHI. β) Κωδική είναι η πάνω αλυσίδα. mRNA: 5΄-AUG-AAA-GGC-CUU-UCU-UGA-3΄. Ολιγοπεπτίδιο: H2N – μεθειονίνη – λυσίνη – γλυκίνη – λευκίνη – σερίνη – COOH.
Το παρακάτω δίκλωνο τμήμα DNA αντιγράφεται in vitro: 5΄-GCTTACGAATTCAGGTATC-3΄ 3΄-CGAATGCTTAAGTCCATAG-5΄ Κατά την αντιγραφή, απέναντι από την πρώτη A της αλληλουχίας GAATTC της πάνω αλυσίδας, η DNA πολυμεράση τοποθετεί κατά λάθος G αντί για T. Το λάθος παραμένει. α) Γράψε τα δίκλωνα μόρια που υπάρχουν μετά την αντιγραφή. β) Πόσα τμήματα DNA θα υπάρχουν αν στο μείγμα προστεθεί EcoRI;
Δείξε τη λύση
α) Ο μηχανισμός είναι ημισυντηρητικός και, επειδή η αντιγραφή γίνεται in vitro, δεν υπάρχουν επιδιορθωτικά ένζυμα να διορθώσουν το λάθος. 1ο μόριο (παλιά πάνω αλυσίδα, νέα κάτω με το λάθος): 5΄-GCTTACGAATTCAGGTATC-3΄ / 3΄-CGAATGCGTAAGTCCATAG-5΄ 2ο μόριο (παλιά κάτω αλυσίδα, νέα πάνω): 5΄-GCTTACGAATTCAGGTATC-3΄ / 3΄-CGAATGCTTAAGTCCATAG-5΄ β) Η EcoRI αναγνωρίζει την αλληλουχία μόνο όταν υπάρχει σωστή και στις δύο αλυσίδες. Κόβει το 2ο μόριο σε δύο τμήματα και αφήνει το 1ο ακέραιο. Σύνολο 3 τμήματα.
Δίνεται ο ανιχνευτής 5΄-CUGAAUCCGA-3΄. Ποια από τις παρακάτω αλυσίδες μπορεί να υβριδοποιήσει; Μόριο Ι, αλυσίδα 1: 5΄…AACTGAATCCGATG…3΄ Μόριο Ι, αλυσίδα 2: 3΄…TTGACTTAGGCTAC…5΄ Μόριο ΙΙ, αλυσίδα 1: 5΄…ATGACTTAGGCTAA…3΄ Μόριο ΙΙ, αλυσίδα 2: 3΄…TACTGAATCCGATT…5΄
Δείξε τη λύση
Ο ανιχνευτής υβριδοποιεί την αλυσίδα που είναι συμπληρωματική και αντιπαράλληλη: 3΄-GACTTAGGCT-5΄. Αυτή υπάρχει στην αλυσίδα 2 του μορίου Ι. Η αλυσίδα 1 του μορίου Ι έχει την ίδια αλληλουχία με τον ανιχνευτή. Η αλυσίδα 1 του μορίου ΙΙ έχει τις συμπληρωματικές βάσεις αλλά με τον ίδιο προσανατολισμό (5΄→3΄), άρα δεν είναι αντιπαράλληλη.
Διαθέτεις δύο ανιχνευτές: Ανιχνευτής Α: 5΄-CCUAGAUUCG-3΄ Ανιχνευτής Β: 5΄-GCTTAGATCC-3΄ Ποιον θα χρησιμοποιούσες για να ανιχνεύσεις ένα γονίδιο του οποίου η κωδική αλυσίδα περιέχει την αλληλουχία 5΄…TTGCAGGATCTAAGCCGT…3΄;
Δείξε τη λύση
Τον Β. Διαβασμένος 3΄→5΄ είναι 3΄-CCTAGATTCG-5΄, δηλαδή συμπληρωματικός και αντιπαράλληλος με το τμήμα 5΄-GGATCTAAGC-3΄ της κωδικής αλυσίδας. Ο Α έχει τις συμπληρωματικές βάσεις προς το ίδιο τμήμα, αλλά με τον ίδιο προσανατολισμό με την κωδική. Δεν είναι αντιπαράλληλος με καμία από τις δύο αλυσίδες του γονιδίου, οπότε δεν υβριδοποιεί.
Το πρόδρομο mRNA ενός γονιδίου έχει 5 εσώνια και 6 εξώνια. Τα εσώνια καταλαμβάνουν το 60% του μήκους του. Το γονίδιο απομονώνεται, αποδιατάσσεται και υβριδοποιείται με το ώριμο mRNA από το κυτταρόπλασμα. α) Ποια αλυσίδα του DNA συμμετέχει στην υβριδοποίηση; β) Τι ποσοστό του mRNA και τι ποσοστό της αλυσίδας του DNA υβριδοποιείται;
Δείξε τη λύση
α) Η μη κωδική, που είναι συμπληρωματική και αντιπαράλληλη με το mRNA. β) Το ώριμο mRNA υβριδοποιείται ολόκληρο (100%). Από την αλυσίδα του DNA υβριδοποιούνται μόνο οι περιοχές που αντιστοιχούν στα εξώνια, δηλαδή το 40% της μεταγραφόμενης περιοχής. Οι 5 περιοχές των εσωνίων μένουν αζευγάρωτες και σχηματίζουν θηλιές.
Δύο μόρια DNA έχουν τις παρακάτω αλληλουχίες. Ποιο αποδιατάσσεται ευκολότερα; Μόριο Α: 5΄-ATTGACATAATTGA-3΄ / 3΄-TAACTGTATTAACT-5΄ Μόριο Β: 5΄-GCCGTACGGCACGT-3΄ / 3΄-CGGCATGCCGTGCA-5΄
Δείξε τη λύση
Στην αποδιάταξη σπάνε οι δεσμοί υδρογόνου. Όσο λιγότεροι είναι, τόσο ευκολότερα αποχωρίζονται οι αλυσίδες. Μόριο Α: 11 ζεύγη A–T και 3 ζεύγη G–C, δηλαδή 2·11 + 3·3 = 31 δεσμοί υδρογόνου. Μόριο Β: 4 ζεύγη A–T και 10 ζεύγη G–C, δηλαδή 2·4 + 3·10 = 38. Ευκολότερα αποδιατάσσεται το Α.
Ένα γονίδιο 1.200 ζευγών βάσεων έχει ακριβώς πριν και ακριβώς μετά από αυτό την αλληλουχία GGATCC, που η BamHI αναγνωρίζει και κόβει ανάμεσα στα δύο G. Ένα πλασμίδιο 3.000 ζευγών βάσεων έχει την αλληλουχία μία φορά. Το πλασμίδιο επωάζεται με BamHI και μετά με αντίγραφα του γονιδίου κομμένα με το ίδιο ένζυμο. Τα πλασμίδια που προέκυψαν είχαν 3.000, 4.206 ή 5.412 ζεύγη βάσεων. Πώς ερμηνεύονται τα μεγέθη αυτά;
Δείξε τη λύση
3.000: το πλασμίδιο ξανάκλεισε χωρίς να πάρει ξένο DNA. 4.206: πήρε ένα αντίγραφο του γονιδίου. Μαζί με το γονίδιο προστίθεται και μία ακόμη θέση αναγνώρισης (6 ζεύγη), αφού η αλληλουχία GGATCC υπάρχει πλέον και στα δύο σημεία ένωσης: 3.000 + 1.200 + 6. 5.412: πήρε δύο αντίγραφα στη σειρά: 3.000 + 2·(1.200 + 6).
Ένα πλασμίδιο έχει δύο γονίδια ανθεκτικότητας, ένα στην αμπικιλλίνη και ένα στην τετρακυκλίνη. Η BamHI κόβει το πλασμίδιο μέσα στο γονίδιο της τετρακυκλίνης και σε ένα ακόμη σημείο εκτός γονιδίων. Η EcoRI το κόβει μία φορά, μέσα στο γονίδιο της αμπικιλλίνης. Η HindIII το κόβει μία φορά, εκτός των γονιδίων. Ποιο από τα τρία ένζυμα είναι το καταλληλότερο για την κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA;
Δείξε τη λύση
Η EcoRI. Κόβει το πλασμίδιο μία μόνο φορά, άρα το ανοίγει χωρίς να χαθεί κομμάτι του. Επιπλέον κόβει μέσα σε γονίδιο ανθεκτικότητας: τα βακτήρια με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο είναι ανθεκτικά στην τετρακυκλίνη αλλά ευαίσθητα στην αμπικιλλίνη, και έτσι ξεχωρίζουν από όσα πήραν πλασμίδιο χωρίς ξένο DNA. Η BamHI κόβει σε δύο σημεία και το πλασμίδιο χωρίζεται σε δύο κομμάτια. Η HindIII δίνει ανασυνδυασμένα πλασμίδια, αλλά και τα δύο γονίδια μένουν λειτουργικά, οπότε δεν διακρίνονται τα βακτήρια με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο από εκείνα με το αρχικό.
Στο σχήμα φαίνονται (i) ένα τμήμα DNA προκαρυωτικού κυττάρου με ένα γονίδιο και τον υποκινητή του (Υ) και (ii) ένα πλασμίδιο που θα χρησιμοποιηθεί ως φορέας κλωνοποίησης. Τα γράμματα δείχνουν τις θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων EcoRI (E), BamHI (B), HindIII (H) και PstI (P). Η αλυσίδα α΄ έχει το 5΄ άκρο της αριστερά.α) Ποια από τις δύο αλυσίδες του γονιδίου είναι η μη κωδική; β) Ποιο από τα τέσσερα ένζυμα είναι το καταλληλότερο για την κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA;
Δείξε τη λύση
α) Η RNA πολυμεράση ξεκινά από τον υποκινητή, που βρίσκεται δεξιά του γονιδίου, και κινείται προς τα αριστερά. Το mRNA συντίθεται 5΄→3΄, άρα έχει το 5΄ άκρο του δεξιά, όπως και η κωδική αλυσίδα. Η β΄ έχει το 5΄ άκρο της δεξιά, άρα είναι η κωδική. Μη κωδική είναι η α΄. β) Η BamHI. Έχει θέσεις και από τις δύο πλευρές του γονιδίου και του υποκινητή του, χωρίς να κόβει μέσα σε αυτά. Στο πλασμίδιο κόβει μία φορά, μέσα στο γονίδιο της τετρακυκλίνης, οπότε τα βακτήρια με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο είναι ανθεκτικά στην αμπικιλλίνη και ευαίσθητα στην τετρακυκλίνη. Η EcoRI κόβει μέσα στο γονίδιο. Η PstI έχει θέση μόνο από τη μία πλευρά του γονιδίου και, στο πλασμίδιο, κόβει στη θέση έναρξης της αντιγραφής. Η HindIII κόβει το πλασμίδιο σε δύο κομμάτια.
Για την κατασκευή μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης διαθέτεις δύο πλασμίδια και δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες, που απομονώθηκαν από το Escherichia coli και από το Streptococcus pneumoniae. Η αλληλουχία που αναγνωρίζει η ενδονουκλεάση του E. coli (EcoRI) υπάρχει δύο φορές στο πλασμίδιο του S. pneumoniae. Η αλληλουχία που αναγνωρίζει η ενδονουκλεάση του S. pneumoniae υπάρχει μία φορά στο πλασμίδιο του E. coli. Κάθε πλασμίδιο έχει ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε διαφορετικό αντιβιοτικό. Ποιον συνδυασμό πλασμιδίου, ενζύμου και βακτηρίου-ξενιστή θα διάλεγες;
Δείξε τη λύση
Το πλασμίδιο πρέπει να κόβεται μία μόνο φορά. Το πλασμίδιο του S. pneumoniae κόβεται δύο φορές από την EcoRI, άρα χωρίζεται σε δύο κομμάτια και δεν είναι κατάλληλο. Διαλέγω το πλασμίδιο του E. coli και την ενδονουκλεάση του S. pneumoniae, με την οποία κόβω και το DNA του δότη. Ξενιστής: βακτήρια E. coli χωρίς πλασμίδια και ευαίσθητα στο αντιβιοτικό του πλασμιδίου. Το S. pneumoniae παράγει την ενδονουκλεάση που αναγνωρίζει τις θέσεις στα σημεία ένωσης του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου και θα το έκοβε.
Ένα πλασμίδιο-φορέας έχει τρία γονίδια ανθεκτικότητας, στην τετρακυκλίνη, στην αμπικιλλίνη και στην καναμυκίνη. Η αλληλουχία που αναγνωρίζει η περιοριστική ενδονουκλεάση βρίσκεται μέσα στο γονίδιο της καναμυκίνης. Τα βακτήρια-ξενιστές έχουν στο κύριο μόριο DNA τους ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στην τετρακυκλίνη. Πώς θα επιλέξεις τα βακτήρια με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο;
Δείξε τη λύση
Υπάρχουν τρία είδη βακτηρίων: χωρίς πλασμίδιο (ανθεκτικά μόνο στην τετρακυκλίνη), με πλασμίδιο χωρίς ξένο DNA (ανθεκτικά και στα τρία) και με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (ανθεκτικά στην τετρακυκλίνη και στην αμπικιλλίνη, ευαίσθητα στην καναμυκίνη). 1. Καλλιεργώ με αμπικιλλίνη: πεθαίνουν όσα δεν πήραν πλασμίδιο. Η τετρακυκλίνη δεν βοηθά, αφού είναι όλα ανθεκτικά. 2. Φτιάχνω στερεές καλλιέργειες, ώστε κάθε βακτήριο να δώσει μια αποικία. 3. Ελέγχω κάθε αποικία παρουσία καναμυκίνης: όσες δεν μεγαλώνουν έχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Τις παίρνω από την αρχική καλλιέργεια.
Ένα μόριο DNA από τον πυρήνα ευκαρυωτικού κυττάρου υποβάλλεται σε 6 κύκλους PCR. Το τελικό προϊόν περιέχει συνολικά 19.200 A και 28.800 C. Βρες τους δεσμούς υδρογόνου του αρχικού μορίου.
Δείξε τη λύση
Μετά από 6 κύκλους υπάρχουν 2⁶ = 64 πανομοιότυπα μόρια. Κάθε μόριο έχει 19.200 ÷ 64 = 300 A και 28.800 ÷ 64 = 450 C. Δεσμοί υδρογόνου: 2·300 + 3·450 = 1.950.
Ένα τμήμα DNA πολλαπλασιάζεται με PCR. Κάθε κύκλος διαρκεί 3 λεπτά και διπλασιάζει το DNA. α) Πόσα αντίγραφα του τμήματος υπάρχουν μετά από 30 λεπτά, αν η αντίδραση ξεκίνησε από ένα μόριο; β) Αν το τμήμα έχει 400 ζεύγη βάσεων, πόσα νουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν στα 30 αυτά λεπτά;
Δείξε τη λύση
α) 30 ÷ 3 = 10 κύκλοι, άρα 2¹⁰ = 1.024 μόρια. β) Κάθε μόριο έχει 800 νουκλεοτίδια. Τα 1.024 μόρια έχουν 819.200, αλλά τα 800 του αρχικού μορίου υπήρχαν ήδη. Χρησιμοποιήθηκαν (1.024 − 1) × 800 = 818.400 νουκλεοτίδια.
Με PCR θέλουμε να φτιάξουμε τουλάχιστον 100 αντίγραφα ενός τμήματος DNA 300 ζευγών βάσεων, ξεκινώντας από ένα μόριο. Κάθε κύκλος διαρκεί 5 λεπτά. α) Πόσος χρόνος χρειάζεται; β) Πόσα νουκλεοτίδια θα υπάρχουν τελικά στα μόρια και πόσα χρειάστηκαν για την κατασκευή τους; γ) Πόσες νέες αλυσίδες συντέθηκαν;
Δείξε τη λύση
α) 2⁶ = 64 < 100 και 2⁷ = 128 ≥ 100, άρα χρειάζονται 7 κύκλοι: 35 λεπτά. β) Κάθε μόριο έχει 600 νουκλεοτίδια. Τελικά υπάρχουν 128 × 600 = 76.800. Χρειάστηκαν 127 × 600 = 76.200, γιατί τα νουκλεοτίδια του αρχικού μορίου υπήρχαν ήδη. γ) Οι αλυσίδες είναι 2 × 128 = 256 και οι 2 είναι οι αρχικές: 254 νέες αλυσίδες.
Ένα μόριο RNA 40 νουκλεοτιδίων χρησιμοποιείται ως ανιχνευτής για μια αλληλουχία ενός γονιδίου. Στον ανιχνευτή ισχύει (A + U) ÷ (G + C) = 3. Από μια βιβλιοθήκη απομονώνονται 8 πλασμίδια που περιέχουν το καθένα μία φορά την αλληλουχία. Τα πλασμίδια αποδιατάσσονται και αναμειγνύονται με 15 μόρια ανιχνευτή. Πόσοι δεσμοί υδρογόνου σχηματίζονται κατά την υβριδοποίηση;
Δείξε τη λύση
A + U + G + C = 40 και A + U = 3·(G + C), άρα G + C = 10 και A + U = 30. Σε κάθε υβριδικό μόριο, κάθε A ή U του ανιχνευτή σχηματίζει 2 δεσμούς και κάθε G ή C 3: 2·30 + 3·10 = 90 δεσμοί υδρογόνου. Η αλληλουχία υπάρχει 8 φορές, άρα από τα 15 μόρια ανιχνευτή υβριδοποιούν τα 8: 8 × 90 = 720.
Ένα ώριμο mRNA 900 νουκλεοτιδίων, στο οποίο G + C = 40%, χρησιμοποιείται για τη σύνθεση δίκλωνου cDNA. α) Ποια ένζυμα χρειάζονται; β) Πόσα δεοξυριβονουκλεοτίδια χρησιμοποιούνται και πόσοι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί σχηματίζονται; γ) Πόσους δεσμούς υδρογόνου έχει το δίκλωνο cDNA;
Δείξε τη λύση
α) Αντίστροφη μεταγραφάση για την πρώτη αλυσίδα και DNA πολυμεράση για τη δεύτερη. β) Δύο αλυσίδες των 900 νουκλεοτιδίων: 1.800 δεοξυριβονουκλεοτίδια. Φωσφοδιεστερικοί: 2 × 899 = 1.798. γ) Το δίκλωνο cDNA έχει 900 ζεύγη. Ζεύγη G–C: 40% × 900 = 360. Ζεύγη A–T: 540. Δεσμοί υδρογόνου: 2·540 + 3·360 = 2.160.