1Βασικοί όροι

Οι όροι του κεφαλαίου ζητούνται συχνά ως ορισμοί στο Θέμα Α και Β. Κρύψε τους ορισμούς και δοκίμασε να τους πεις μόνος σου.

Ανασυνδυασμένο DNA

Τεχνητό μόριο DNA που περιέχει γονίδια ή τμήματα DNA από δύο ή περισσότερους οργανισμούς.

Ανιχνευτής

Ιχνηθετημένο μονόκλωνο μόριο DNA ή RNA με αλληλουχία συμπληρωματική προς το DNA που ψάχνουμε. Υβριδοποιεί μόνο αυτό και έτσι δείχνει ποιος κλώνος το περιέχει.

Αντίστροφη μεταγραφάση

Ένζυμο που συνθέτει DNA με καλούπι RNA. Στο κεφάλαιο αυτό φτιάχνει cDNA με καλούπι το ώριμο mRNA.

Αποδιάταξη

Ο αποχωρισμός των δύο αλυσίδων του DNA. Γίνεται με θέρμανση ή με κατάλληλες χημικές ουσίες, που σπάνε τους δεσμούς υδρογόνου ανάμεσα στις αλυσίδες.

Βακτηριοφάγος λ

Ιός που προσβάλλει βακτήρια. Το DNA του χρησιμοποιείται ως φορέας κλωνοποίησης και δέχεται μεγαλύτερα κομμάτια ξένου DNA από τα πλασμίδια.

Γενετική Μηχανική

Το σύνολο των τεχνικών με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό.

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη

Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού-δότη.

DNA δεσμάση

Ένζυμο που ενώνει με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς το DNA του δότη με το DNA του φορέα, αφού ζευγαρώσουν τα μονόκλωνα άκρα τους.

EcoRI

Περιοριστική ενδονουκλεάση από το βακτήριο Escherichia coli. Αναγνωρίζει την αλληλουχία 5΄-GAATTC-3΄ στο δίκλωνο DNA και κόβει κάθε αλυσίδα ανάμεσα στο G και στο A.

Κλωνοποίηση

Η δημιουργία κλώνων βακτηρίων, δηλαδή πολλών πανομοιότυπων αντιγράφων ενός τμήματος DNA μέσα σε βακτήρια. Γενικότερα, η παραγωγή μεγάλου αριθμού πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών.

Κλώνος βακτηρίων

Ομάδα γενετικά όμοιων βακτηρίων που έχουν προκύψει από ένα αρχικό βακτήριο με διαδοχικές διαιρέσεις.

Κύτταρο-ξενιστής

Το κύτταρο, συνήθως βακτήριο, που δέχεται το ανασυνδυασμένο DNA και το πολλαπλασιάζει.

Μετασχηματισμός

Η εισαγωγή ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε βακτήριο-ξενιστή. Γίνεται με κατάλληλη κατεργασία, που κάνει τα τοιχώματα του βακτηρίου παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια.

Μονόκλωνα άκρα

Άκρα με αζευγάρωτες βάσεις που αφήνει η EcoRI στα κομμένα τμήματα (5΄-AATT-3΄). Ζευγαρώνουν με τα συμπληρωματικά άκρα άλλων τμημάτων που κόπηκαν με το ίδιο ένζυμο.

Οργανισμός-δότης

Ο οργανισμός από τον οποίο προέρχεται το DNA που κλωνοποιούμε.

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες

Ένζυμα βακτηρίων που αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4 έως 8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA και το κόβουν εκεί. Προστατεύουν το βακτήριο από την εισβολή ξένου DNA.

Πλασμίδιο

Μικρό κυκλικό δίκλωνο μόριο DNA των βακτηρίων, που αντιγράφεται ανεξάρτητα από το κύριο μόριο DNA. Είναι ο συνηθέστερος φορέας κλωνοποίησης.

PCR

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Μέθοδος που αντιγράφει επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές, ειδικές αλληλουχίες DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανών κυττάρων.

Υβριδοποίηση

Η σύνδεση, με δεσμούς υδρογόνου, δύο μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA ή μιας αλυσίδας DNA με μια συμπληρωματική αλυσίδα RNA.

Φορέας κλωνοποίησης

Μόριο DNA (πλασμίδιο ή DNA φάγου) που δέχεται ξένο DNA, το μεταφέρει σε κύτταρο-ξενιστή και αντιγράφεται ανεξάρτητα μέσα σε αυτό.

cDNA

Συμπληρωματικό DNA. Συντίθεται από την αντίστροφη μεταγραφάση με καλούπι ώριμο mRNA, άρα δεν περιέχει εσώνια ούτε υποκινητή.

cDNA βιβλιοθήκη

Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα.

Δεν βρέθηκε όρος.

2Γενετική Μηχανική και ανασυνδυασμένο DNA

Οι τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό αποτελούν τη Γενετική Μηχανική. Με αυτές ο άνθρωπος μπορεί όχι μόνο να ερευνά αλλά και να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών. Η Γενετική Μηχανική άνοιξε τον δρόμο για νέες παραγωγικές και ερευνητικές δυνατότητες και υπηρετεί δύο θεμελιώδεις στόχους του ανθρώπου: την κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης, και τη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσής του.

Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές που οδηγούν σε μεταφορά γενετικού υλικού από έναν οργανισμό σε άλλον. Εφαρμόζεται στην παραγωγή πρωτεϊνών και άλλων προϊόντων και στη δημιουργία φυτών και ζώων με «βελτιωμένες» ιδιότητες.

Τα στάδια

1. Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA. Ένα τεχνητό μόριο DNA με γονίδια από δύο ή περισσότερους οργανισμούς.
2. Μεταφορά σε κύτταρο-ξενιστή. Συνήθως σε βακτήριο, με τη διαδικασία του μετασχηματισμού.
3. Επιλογή των ξενιστών. Απομονώνονται τα κύτταρα που πήραν το ανασυνδυασμένο DNA.
4. Επιλογή του κλώνου. Εντοπίζεται ο βακτηριακός κλώνος που περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA.

3Περιοριστικές ενδονουκλεάσες

Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια. Ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να τα προστατεύουν από την εισβολή «ξένου» DNA, π.χ. του DNA ενός φάγου. Αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4 έως 8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA και το κόβουν εκεί. Η ανακάλυψή τους έκανε δυνατή την κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA.

Η πιο γνωστή είναι η EcoRI, από το βακτήριο Escherichia coli. Όποτε συναντά την αλληλουχία 5΄-GAATTC-3΄, κόβει κάθε αλυσίδα ανάμεσα στο G και στο A (με κατεύθυνση 5΄→3΄). Επειδή οι δύο τομές δεν είναι απέναντι, στα κομμένα άκρα μένουν μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις.

• Δεσμοί που σπάνε ανά θέση κοπής2 φωσφοδιεστερικοί (ένας σε κάθε αλυσίδα) και 8 δεσμοί υδρογόνου (τα 4 ζεύγη A–T ανάμεσα στις δύο τομές)
• Γραμμικό DNA με ν θέσειςκόβεται σε ν + 1 κομμάτια
• Κυκλικό DNA με ν θέσειςκόβεται σε ν κομμάτια

4Κλωνοποίηση: φορείς, μετασχηματισμός, επιλογή

Για να πολλαπλασιαστεί ένα κομμάτι DNA μέσα σε βακτήρια χρειάζεται έναν φορέα κλωνοποίησης: ένα μόριο DNA που αντιγράφεται ανεξάρτητα μέσα στο κύτταρο-ξενιστή. Φορείς είναι τα πλασμίδια και το DNA φάγων, όπως του βακτηριοφάγου λ. Τα πλασμίδια είναι ο συνηθέστερος φορέας, αλλά δέχονται σχετικά μικρά κομμάτια ξένου DNA. Το DNA των φάγων δέχεται μεγαλύτερα. Η διαδικασία είναι παρόμοια και στις δύο περιπτώσεις.

Το κατάλληλο πλασμίδιο

• Μία θέση αναγνώρισηςέχει την αλληλουχία που αναγνωρίζει το ένζυμο μία μόνο φορά, ώστε να ανοίγει και να γίνεται γραμμικό χωρίς να χάνει κομμάτι
• Γονίδιο ανθεκτικότηταςσε αντιβιοτικό, π.χ. αμπικιλλίνη, για να ξεχωρίζουν τα βακτήρια που το πήραν
• Ανεξάρτητη αντιγραφήδιαθέτει θέση έναρξης αντιγραφής και πολλαπλασιάζεται μέσα στον ξενιστή

Κατασκευή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου

Το DNA του δότη και το πλασμίδιο κόβονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση, ώστε να έχουν συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα. Όταν αναμειχθούν, τα άκρα ζευγαρώνουν με δεσμούς υδρογόνου και η DNA δεσμάση ενώνει τα τμήματα με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.

Μετασχηματισμός και επιλογή

1. Μετασχηματισμός. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια-ξενιστές. Με κατάλληλη κατεργασία τα τοιχώματά τους γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια.
2. Καλλιέργεια με αντιβιοτικό. Οι ξενιστές δεν είχαν πλασμίδια και ήταν ευαίσθητοι στο αντιβιοτικό. Όσοι δεν πήραν πλασμίδιο πεθαίνουν. Όσοι πήραν, επιβιώνουν χάρη στο γονίδιο ανθεκτικότητας.
3. Κλώνοι. Κάθε μετασχηματισμένο βακτήριο διαιρείται και δίνει έναν κλώνο, δηλαδή πολλά γενετικά όμοια βακτήρια με το ίδιο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.

Επιλογή με δύο γονίδια ανθεκτικότητας

Αν η θέση κοπής βρίσκεται μέσα σε ένα γονίδιο ανθεκτικότητας, το ξένο DNA το διακόπτει και το γονίδιο παύει να λειτουργεί. Έστω πλασμίδιο με γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά Α και Β, και θέση κοπής μέσα στο γονίδιο για το Β:

Τα βακτήρια που μας ενδιαφέρουν είναι όσα μεγαλώνουν στο Α αλλά όχι στο Β. Η θέση κοπής δεν πρέπει ποτέ να βρίσκεται στη θέση έναρξης της αντιγραφής, ούτε να υπάρχει δύο φορές στο πλασμίδιο.

5Γονιδιωματική βιβλιοθήκη

Σκοπός: να δημιουργηθούν βακτηριακοί κλώνοι που όλοι μαζί περιέχουν το συνολικό DNA ενός οργανισμού-δότη.

1. Απομονώνεται το ολικό DNA από κύτταρα του δότη, καθώς και τα κατάλληλα πλασμίδια.
2. Το DNA του δότη και τα πλασμίδια κόβονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση. Το DNA του δότη δίνει χιλιάδες κομμάτια.
3. Τα δύο είδη DNA αναμειγνύονται και, με τη βοήθεια της DNA δεσμάσης, σχηματίζονται ανασυνδυασμένα πλασμίδια.
4. Τα βακτήρια-ξενιστές μετασχηματίζονται με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια.
5. Τα βακτήρια καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό με το κατάλληλο αντιβιοτικό και επιλέγονται όσα έχουν πλασμίδιο.
6. Κάθε βακτήριο δίνει έναν κλώνο. Το σύνολο των κλώνων είναι η γονιδιωματική βιβλιοθήκη.

• Τι περιέχει κάθε κλώνοςένα κομμάτι του DNA του δότη: ολόκληρο γονίδιο, μέρος γονιδίου ή DNA που δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη
• Εσώνια και υποκινητέςυπάρχουν, αφού κλωνοποιείται το ίδιο το DNA του δότη
• Από ποιο κύτταροείναι ίδια από όποιο σωματικό κύτταρο του οργανισμού κι αν φτιαχτεί, γιατί όλα έχουν το ίδιο DNA

6cDNA βιβλιοθήκη

Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς κάθε κυτταρικός τύπος εκφράζει μόνο ορισμένα γονίδια. Αν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα, φτιάχνουμε cDNA βιβλιοθήκη. Αυτή περιέχει αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα αυτά. Πλεονέκτημά της είναι ότι απομονώνονται μόνο οι αλληλουχίες που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δηλαδή τα εξώνια.

Παράδειγμα: για το γονίδιο της β-πολυπεπτιδικής αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης παίρνουμε mRNA από πρόδρομα ερυθροκύτταρα, όπου το γονίδιο εκφράζεται έντονα.

1. Απομονώνονται τα κύτταρα στα οποία εκφράζεται το γονίδιο που μας ενδιαφέρει.
2. Απομονώνεται το ολικό ώριμο mRNA των κυττάρων αυτών.
3. Με καλούπι το mRNA, η αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει συμπληρωματικές αλυσίδες DNA (cDNA). Προκύπτουν υβριδικά μόρια mRNA–cDNA.
4. Το mRNA διασπάται με κατάλληλες χημικές ουσίες ή απομακρύνεται με θέρμανση, και μένουν μονόκλωνες αλυσίδες cDNA.
5. Με καλούπι το cDNA, η DNA πολυμεράση συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα. Προκύπτουν δίκλωνα μόρια DNA.
6. Τα δίκλωνα μόρια εισάγονται σε πλασμίδια (ή σε DNA φάγων) με περιοριστική ενδονουκλεάση και DNA δεσμάση.
7. Τα βακτήρια-ξενιστές μετασχηματίζονται, καλλιεργούνται με αντιβιοτικό και επιλέγονται.
8. Οι κλώνοι που προκύπτουν είναι η cDNA βιβλιοθήκη.

7Αποδιάταξη, υβριδοποίηση και ανιχνευτές

Μια βιβλιοθήκη έχει χιλιάδες κλώνους. Για να βρούμε εκείνον που περιέχει το κομμάτι DNA που μας ενδιαφέρει, αξιοποιούμε τη συμπληρωματικότητα των βάσεων.

• Αποδιάταξημε θέρμανση ή κατάλληλες χημικές ουσίες σπάνε οι δεσμοί υδρογόνου και οι δύο αλυσίδες αποχωρίζονται, χωρίς να καταστραφούν
• Υβριδοποίησησε κατάλληλες συνθήκες, μονόκλωνες συμπληρωματικές αλυσίδες DNA, ή DNA με RNA, συνδέονται ξανά μεταξύ τους

1. Φτιάχνεται ένας ανιχνευτής: ιχνηθετημένο μονόκλωνο μόριο DNA ή RNA με αλληλουχία συμπληρωματική προς το DNA που ψάχνουμε.
2. Το DNA των κλώνων της βιβλιοθήκης αποδιατάσσεται.
3. Οι ανιχνευτές αναμειγνύονται με το αποδιαταγμένο DNA και υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό τους DNA.
4. Η ιχνηθέτηση δείχνει ποιος κλώνος περιέχει το επιθυμητό τμήμα. Ο κλώνος αυτός απομονώνεται και καλλιεργείται.

8Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Η PCR επιτρέπει να αντιγράψουμε επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές, ειδικές αλληλουχίες DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανών κυττάρων. Άρχισε να εφαρμόζεται ευρέως το 1985 και αύξησε πολύ την ευαισθησία των γενετικών αναλύσεων.

Εφαρμογές

• Ιατρικήδιάγνωση ασθενειών, όπως το AIDS
• Εγκληματολογίαδιαλεύκανση υποθέσεων από ελάχιστες ποσότητες αίματος ή άλλων ιστών
• Μελέτη απολιθωμάτωνανάλυση DNA από απολιθώματα

Πώς γίνεται

Πρέπει να γνωρίζουμε την αλληλουχία στα άκρα του τμήματος που θέλουμε να αντιγράψουμε. Με βάση αυτήν συντίθενται δύο μικρά ολιγονουκλεοτίδια, συμπληρωματικά προς τα άκρα κάθε αλυσίδας. Στον δοκιμαστικό σωλήνα μπαίνουν το DNA, τα ολιγονουκλεοτίδια, ελεύθερα δεοξυριβονουκλεοτίδια και μια DNA πολυμεράση ανθεκτική στις υψηλές θερμοκρασίες.

1. Αποδιάταξη. Ο σωλήνας θερμαίνεται και οι δύο αλυσίδες του DNA αποχωρίζονται.
2. Σύνδεση των ολιγονουκλεοτιδίων. Ο σωλήνας ψύχεται και τα ολιγονουκλεοτίδια ζευγαρώνουν με τις συμπληρωματικές περιοχές κάθε αλυσίδας.
3. Επέκταση. Η DNA πολυμεράση ξεκινά από τα ολιγονουκλεοτίδια και συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα.

Τα τρία βήματα είναι ένας κύκλος και διαρκούν λίγα λεπτά. Σε κάθε κύκλο ο αριθμός των μορίων διπλασιάζεται.

9Συγκρίσεις

10Αυτοέλεγχος

Δώδεκα γρήγορες ερωτήσεις. Πάτα μια απάντηση για να δεις αν είναι σωστή.

1. Η EcoRI κόβει κάθε αλυσίδα της αλληλουχίας 5΄-GAATTC-3΄ ανάμεσα:

   στο A και το Tστο G και το Aστο T και το Cστα δύο T

   Κόβει μεταξύ G και A, με κατεύθυνση 5΄→3΄, και αφήνει μονόκλωνα άκρα AATT.

2. Ο φυσιολογικός ρόλος των περιοριστικών ενδονουκλεασών είναι:

   η αντιγραφή του DNA του βακτηρίουη προστασία του βακτηρίου από ξένο DNAη σύνθεση πλασμιδίωνη επιδιόρθωση του DNA

   Παράγονται από βακτήρια και κόβουν το DNA που εισβάλλει, π.χ. το DNA φάγων.

3. Ποιο ένζυμο ενώνει το DNA του δότη με το πλασμίδιο;

   Η περιοριστική ενδονουκλεάσηΗ DNA πολυμεράσηΗ DNA δεσμάσηΗ αντίστροφη μεταγραφάση

   Η DNA δεσμάση σχηματίζει τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς αφού ζευγαρώσουν τα μονόκλωνα άκρα.

4. Η εισαγωγή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου στο βακτήριο λέγεται:

   κλωνοποίησηυβριδοποίησηαποδιάταξημετασχηματισμός

   Τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια.

5. Τα βακτήρια-ξενιστές πριν από τον μετασχηματισμό πρέπει:

   να έχουν πλασμίδια και να είναι ανθεκτικάνα μην έχουν πλασμίδια και να είναι ευαίσθητα στο αντιβιοτικόνα έχουν περιοριστικές ενδονουκλεάσεςνα περιέχουν το γονίδιο που ψάχνουμε

   Έτσι στο αντιβιοτικό επιβιώνουν μόνο όσα πήραν πλασμίδιο.

6. Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη περιέχει:

   μόνο τα γονίδια που εκφράζονταιμόνο τα εξώνιατο συνολικό DNA του οργανισμού-δότημόνο τα mRNA ενός ιστού

   Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων με όλο το DNA του δότη, κομμένο σε τμήματα.

7. Το cDNA συντίθεται με καλούπι:

   το πρόδρομο mRNAτο ώριμο mRNAτη μη κωδική αλυσίδα του γονιδίουένα πλασμίδιο

   Γι’ αυτό δεν έχει εσώνια. Η σύνθεση γίνεται από την αντίστροφη μεταγραφάση.

8. Για να παραχθεί ανθρώπινη πρωτεΐνη από βακτήρια προτιμάμε cDNA βιβλιοθήκη, γιατί:

   είναι φθηνότερητα βακτήρια δεν κάνουν ωρίμανση και το cDNA δεν έχει εσώνιατο cDNA είναι μονόκλωνοτο cDNA έχει δικό του υποκινητή

   Ένα γονίδιο με εσώνια δεν θα έδινε σωστή πρωτεΐνη σε βακτήριο.

9. Η αποδιάταξη του DNA σπάει:

   φωσφοδιεστερικούς δεσμούςπεπτιδικούς δεσμούςδεσμούς υδρογόνουόλους τους δεσμούς του μορίου

   Οι αλυσίδες αποχωρίζονται αλλά μένουν ανέπαφες.

10. Ένας ανιχνευτής υβριδοποιεί μια αλυσίδα DNA όταν είναι:

    ίδιος με αυτήνσυμπληρωματικός και αντιπαράλληλος με αυτήνσυμπληρωματικός και παράλληλος με αυτήνμεγαλύτερος από αυτήν

    Η συμπληρωματικότητα δεν αρκεί. Χρειάζεται και αντίθετος προσανατολισμός.

11. Η PCR γίνεται:

    μέσα σε βακτήριαμέσα σε ευκαρυωτικά κύτταρασε δοκιμαστικό σωλήνα, χωρίς ζωντανά κύτταραμόνο με RNA ως καλούπι

    Αυτή είναι η βασική διαφορά της από την κλωνοποίηση σε βακτήρια.

12. Από ένα δίκλωνο μόριο DNA, μετά από 6 κύκλους PCR, υπάρχουν:

    12 μόρια32 μόρια36 μόρια64 μόρια

    Σε κάθε κύκλο τα μόρια διπλασιάζονται: 2⁶ = 64.